Estudos espectroscópicos da hemoglobina de Glossoscolex paulistus (HbGp) modificada pela sonda Fluoresceína isotiocianato e caracterização da apo-HbGp na ausência e presença da sonda 1-Anilino-8-naftaleno-sulfonato (ANS).
A hemoglobina extracelular de Glossoscolex paulistus tem uma massa molecular de 3,6 MDa, determinada por ultracentrifugação analítica. Esta proteína possui uma estrutura oligomérica composta por 144 cadeias globínicas e 36 cadeias sem o grupo heme, denominadas linkers. A HbGp é caracterizada por apr...
| Autor: | |
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| Formato: | tesis doctoral |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2019 |
| País: | Brasil |
| Recursos: | Universidade de São Paulo (USP) |
| Repositorio: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
| Idioma: | portugués |
| OAI Identifier: | oai:teses.usp.br:tde-17042019-162139 |
| Acesso em linha: | http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75134/tde-17042019-162139/ |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palavra-chave: | ANS apo-HbGp FITC HbGp hemoglobin extracellular hemoglobina extracelular |
| Resumo: | A hemoglobina extracelular de Glossoscolex paulistus tem uma massa molecular de 3,6 MDa, determinada por ultracentrifugação analítica. Esta proteína possui uma estrutura oligomérica composta por 144 cadeias globínicas e 36 cadeias sem o grupo heme, denominadas linkers. A HbGp é caracterizada por apresentar uma alta resistência a auto-oxidação e uma alta estabilidade oligomérica quando submetida a condições de estresse, tais como, variações de temperatura, pH e adição de agentes químicos (ureia, GuHCl e surfactantes). A primeira parte dos resultados desse trabalho descreve a estabilidade oligomérica da oxi-HbGp na presença de ureia, no pH 7,0 monitorada pela sonda de fluorescência fluoresceína isotiocianato (FITC). Este estudo foi desenvolvido através do uso de várias técnicas espectroscópicas tais como: absorção óptica no UV-VIS, emissão de fluorescência estática e resolvida no tempo, anisotropia estática e decaimento de anisotropia. Os tempos de vida de emissão de fluorescência dos triptofanos e da sonda FITC foram obtidos. Os decaimentos dos triptofanos são multi-exponenciais com quatro tempos de vida, onde dois estão na faixa de picosegundos e dois na faixa de nanosegundos. Os decaimentos de emissão dos triptofanos da oxi-HbGp pura e da oxi-HbGp modificada com FITC são bastante similares. Na ausência do desnaturante e na presença de até 2,5 mol/L de ureia os tempos curtos são predominantes. Em 3,5 e 6,0 mol/L de ureia as contribuições dos tempos longos aumentam significativamente. O processo de desenovelamento da oxi-HbGp induzido pela ureia é caracterizado pela dissociação oligomérica da proteína e desnaturação das subunidades dissociadas. Os decaimentos de emissão da sonda para o sistema FITC-HbGp são também multi-exponenciais com três tempos de vida, onde um dos tempos, na faixa de nanosegundos, é semelhante ao da sonda livre em tampão de 3,9 ns. Com o aumento da concentração de ureia, as contribuições dos tempos longos aumentam implicando a remoção da supressão observada para a emissão da sonda no sistema HbGp-FITC. Por outro lado, os decaimentos de anisotropia são caracterizados por dois tempos de correlação rotacional, associados, respectivamente, ao movimento residual da sonda em relação à proteína. Na segunda parte desse trabalho a forma apo-HbGp, ou seja, a oxi-HbGp sem os grupos hemes foi estudada através de um conjunto de técnicas: eletroforese, ultracentrifugação analítica (AUC), espalhamento dinâmico de luz (DLS), absorção óptica no UV-Vis, dicroísmo circular (CD), fluorescência estática e resolvida no tempo, na ausência e na presença da sonda 1-Anilino-8-naftaleno-sulfonato (1,8-ANS). Além disso, a concentração da apo-HbGp foi determinada pelo método do ácido bicinconínico (BCA). A partir dessa concentração o coeficiente de extinção molar foi calculado utilizando a lei de Beer-Lambert. Os dados de AUC mostraram duas espécies em solução, correspondendo ao monômero d e trímero abc, com coeficientes de sedimentação em torno de 2,0 e 3,5 S, respectivamente. Pelos dados de DLS percebe-se que a forma apo-HbGp monitorada por longos períodos de tempo é muito instável quando comparada à oxi-HbGp. No estudo de fluorescência resolvida no tempo da apo-HbGp foi observado à predominância de tempos longos, uma vez que os grupos hemes que promovem a supressão da emissão de fluorescência dos triptofanos foram removidos. Três tempos de vida são observados sendo dois longos na faixa de nano-segundos e um na faixa de sub-nano-segundos. |
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