Caracterización molecular del bacteriófago BAM35. Mecanismo de replicación del DNA y estudio del interactoma proteico

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17-02-2017

Detalles Bibliográficos
Autor: Berjón Otero, Mónica Rosa
Tipo de recurso: tesis doctoral
Fecha de publicación:2017
País:España
Institución:Universidad Autónoma de Madrid
Repositorio:Biblos-e Archivo. Repositorio Institucional de la UAM
Idioma:español
OAI Identifier:oai:repositorio.uam.es:10486/678514
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/10486/678514
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Bacteriófagos - Tesis doctorales
Biología y Biomedicina / Biología
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Redrejo Rodríguez, Modesto
Departamento de Biología Molecular
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Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBM)
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spelling Caracterización molecular del bacteriófago BAM35. Mecanismo de replicación del DNA y estudio del interactoma proteicoBerjón Otero, Mónica RosaBacteriófagos - Tesis doctoralesBiología y Biomedicina / BiologíaTesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17-02-2017Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 17-08-2018Los miembros de la familia Tectiviridae se clasifican en dos grupos: fagos líticos que infectan a bacterias Gram-negativas y fagos atemperados cuyo hospedador son bacterias Gram-positivas. Mientras que el primer grupo, y más concretamente PRD1, ha sido ampliamente estudiado, no se conoce en detalle la biología de los bacteriófagos pertenecientes al segundo grupo. Con el objetivo de ampliar el conocimiento científico de los tectivirus que infectan a Gram-positivas y establecer un nuevo modelo de estudio dentro de este grupo, el presente trabajo se focalizó en el estudio de la replicación del genoma y de la interacción entre todas las proteínas del bacteriófago Bam35. La DNA polimerasa de Bam35 (B35DNAP), codificada por el marco de lectura abierto 5 (ORF5) de su genoma, pertenece a la familia B y presenta los subdominios TPR1 y TPR2, característicos de las DNA polimerasas (DNAPs) que inician la replicación del material genético utilizando una proteína terminal (TP) como primer. La caracterización bioquímica de esta enzima mostró una polimerización altamente procesiva asociada al desplazamiento de banda. Además, posee actividad exonucleasa 3´-5´que actúa de manera coordinada con la actividad polimerasa y que, junto a la especificidad de inserción del nucleótido dictado por la hebra molde, le confiere una fidelidad comparable con la de otras DNAPs replicativas, como las habitualmente empleadas para amplificar DNA. A pesar de su alta fidelidad, la B35DNAP es también capaz de replicar un molde de DNA con sitios abásicos insertando, preferentemente, una adenina enfrente del daño y sin producir cambios en el marco de lectura. Además, la deleción del subdominio TPR2, requerido para la procesividad, impide la extensión del primer más allá del daño. Por otro lado, la caracterización funcional y bioquímica de la proteína codificada por el ORF4 del genoma de Bam35 demostró que dicha proteína es la TP viral, que actúa como primer en la replicación. La B35DNAP utiliza la tercera base del extremo 3´ del DNA como molde para catalizar la formación de un enlace fosfoéster entre el nucleótido complementario y el grupo OH de la tirosina 194 de la TP. A continuación, el complejo de iniciación se puede translocar hacia atrás mediante un nuevo mecanismo de jumping-back de un nucleótido para recuperar la información genética del extremo. Por último, el presente estudio muestra la información obtenida del análisis generalizado entre las interacciones de las proteínas codificadas por el genoma de Bam35. Los datos obtenidos nos permiten proponer a la proteína P17 como proteína minoritaria de la cápsida y a la P24 como proteína del pentón. Además, la proteína hidrolítica de la membrana interna P26 podría tener una función estructural clave, ya que interacciona tanto con otras proteínas de membrana como con proteínas del pentón y del vértice especial. Por último, en las demás interacciones observadas están implicadas 10 proteínas más de función aún desconocida.The members of the Tectiviridae family can be subdivided into two groups: lytic bacteriophages that infect Gram-negative bacteria and temperate phages whose hosts are Gram-positive bacteria. While the first group, namely PRD1, has been deeply studied, the biology of the bacteriophages belong to the second group is not well known. Therefore, to extend the knowledge of the tectiviruses that infect Gram-positive bacteria and to establish a new working model for this group, the present work is focused on the study of the genome replication and the protein-protein interactions of the Bam35 bacteriophage. The Bam35 DNA polymerase (B35DNAP), encoded by the open reading frame 5 (ORF5) of its genome, belongs to the B family and contains the TPR1 and TPR2 subdomains, which are the hallmark of DNA polymerases (DNAPs) that initiate the replication using a terminal protein (TP) as a primer. The biochemical characterization of this enzyme showed a highly processive polymerization coupled to strand displacement. In addition, the B35DNAP has a 3´-5´ exonuclease activity that acts in a coordinated manner with the polymerization activity. This activity, together with the specificity of insertion of the nucleotide dictated by the template strand, provides to the B35DNAP a fidelity rate similar to other replicative DNAPs generally used to amplify DNA. In spite of its high fidelity, the B35DNAP is able to replicate a template with abasic sites. To do this, this enzyme inserts, preferably, an adenine opposite the damage and resume replication without generating a frameshift. Moreover, deletion of the TPR2 subdomain, required for processivity, impairs primer extension beyond the abasic site. On the other hand, the functional and biochemical characterization of the protein encoded by the ORF4 of the Bam35 genome, showed that this protein acts as a primer during the DNA replication. The B35DNAP uses the third nucleotide at the 3´ end of the DNA as the template to catalyse the formation of the phosphoester bound of the complementary nucleotide to an OH group of the tyrosine 194 residue of the TP. Subsequently, the initiation complex can translocate backward through a single-nucleotide jumping-back mechanism to recover the genetic information of the genome ends. Finally, the information obtained from the high-throughput analysis between the interactions of all the proteins codified by the Bam35 genome allows us to propose the P17 protein as the minor capsid protein of Bam35 and P24 as the penton protein. Besides, the P26 inner membrane hydrolytic protein could have an important structural function due to its interactions both with other inner membrane proteins and penton and special vertex proteins. Finally, in the rest of the observed interactions there are 10 more proteins with yet an unknown function.Salas Falgueras, MargaritaRedrejo Rodríguez, ModestoDepartamento de Biología MolecularFacultad de CienciasCentro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBM)20172017-02-17doctoral thesishttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06NAhttp://purl.org/coar/version/c_be7fb7dd8ff6fe43info:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10486/678514reponame:Biblos-e Archivo. Repositorio Institucional de la UAMinstname:Universidad Autónoma de MadridEspañolspaopen accesshttp://purl.org/coar/access_right/c_abf2info:eu-repo/semantics/openAccessoai:repositorio.uam.es:10486/6785142026-06-23T12:46:27Z
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