Optimización del metabolismo de polihidroxialcanoatos de Pseudomonas putida KT2440 mediante abordajes de biología sintética y de sistemas

248 pags.-72 fig.-34 tab.- anexos

Detalles Bibliográficos
Autor: Manoli, Maria-Tsampika
Tipo de recurso: tesis doctoral
Fecha de publicación:2020
País:España
Institución:Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)
Repositorio:DIGITAL.CSIC. Repositorio Institucional del CSIC
OAI Identifier:oai:digital.csic.es:10261/226479
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/10261/226479
Access Level:acceso abierto
Palabra clave:Pseudomonas putida
Metabolismo
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Modelos metabólicos a escala genómica
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spelling Optimización del metabolismo de polihidroxialcanoatos de Pseudomonas putida KT2440 mediante abordajes de biología sintética y de sistemasManoli, Maria-TsampikaPseudomonas putidaMetabolismoPolidroxialcanoatosModelos metabólicos a escala genómica248 pags.-72 fig.-34 tab.- anexosEN Pseudomonas putida KT2440 is a model environmental bacterium attracting considerable interest as a cell-factory through synthetic and systems biology approaches. Its metabolism has been extensively characterized and a high-qualitymetabolic model is available (iJN1441), allowing for the systems evaluation of its metabolic capabilities. Among its biotechnological applications, KT2440 is widely used for the production of polyhydroxyalkanoates (PHA), also known as bacterial polyestersor bioplastics. This family of polyesters presents interesting properties for replacing fossil fuel-based plastics. PHA metabolism in P. putida is mediated through the PHA polymerase (PhaC) and the PHA depolymerase (PhaZ) that synthesizes and degrades PHA, respectively, in a continuous cycle. The PHA are accumulated in the cytoplasm as carbon and energy stores, and contrary to oil-based plastic, they are produced fromrenewable resources. PHA metabolism goes beyond solely having a role in carbon storage since recent findings have highlighted its function as a balancing route that increases P. putida fitness during environmental perturbations In the first Results chapter, validations of the PHA cycle in conferring robustness to P. putida will be described in depth. In order to assess the effect of blocking the PHA turnover in the cell, a phaZ null strain was constructed. We then validated a library of strains expressing phaZ over a range of levels in this ΔphaZ background. To investigate the impact of tuning phaZ expression on Pseudomonas metabolism, key physiological parameters were analyzed under PHA production conditions. A variety of physiological responses were observed, resulting in changes in cell number, cell size, PHA accumulation and production of extracellular (R)-Hydroxyalkanoic acids ((R)-HAs) as compared between wild type and phaZ null strains. These observations suggest arerouting of the cellular carbon flux when the PHA cycle is disrupted. Overall, phaZ variant strains have shown important differences including growth rate, octanoate consumption rate, residual octanoate and a panel of extracellular metabolites. To get a glance of the overall metabolism, these experimental data were contextualized into the in silico metabolic model (iJN1411). The systems impact of the PHA cycle in the physiology of this model bacterium, including the presence of a residual oxidative metabolism under stationary growth phase, associated to high flux through PHA cyclewill be discussed.In the second Results chapter, studies were carried out to address the physiological roles of the prokaryotic isocitrate dehydrogenase isoenzymes (PIDH) in P. putida and the role of functional redundancy as mechanism of metabolic robustness in this bacterium. PIDH is an ancient and highly diverse enzyme. There are many examplesin the literature of works characterizing the biochemical and enzymatic properties of these enzymes in a variety of microorganisms. However, it is not clear why two PIDH are present in pseudomonads in terms of microbial physiology, since this is a characteristic more commonly observed and studied in psychrophiles. The results for the purification and enzymatic characterization of the two PIDH from P. putida is presented. The key amino acid residues for catalytic activity of the monomeric PIDH (idh) were verified by site-directed mutagenesis experiments. In order to study the impact of having two PIDH, the expression levels of both genes were assessed by qRT-PCR experiments under different growth conditions. Finally, in order to study the role of the two PIDH in P. putida physiology and metabolism, different isocitrate dehydrogenase deletion mutants were designed. After several tries, we were capable to obtain only the dimeric PIDH (icd) deletion mutant, suggesting that monomeric idh could be an essential gene in P. putida.The third Results chapter delves into the creation of biofactories producing PHA from complex and poor PHA substrates. In particular, PHA substrates generated from the breakdown of lignin and the fossil fuel-based plastics, polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU). We present a set of in silico growth-coupled PHA overproducer P. putida strains, using monomers derived from the hydrolysis of these polymers, as carbon sources. We applied an iterative DBTL cycle in order to achieve this goal. The model of P. putida, iJN1411, was used as a computational platform to in silico designing of growth-coupled strains. Subsequently, these in silico designs were implemented, evaluated and optimized in vivo. Cutting edge synthetic biology approaches were used to generate the high number of gene knockouts and knockins required to systematically remove all potential competing pathways and to reroute the carbon flux towards PHA biosynthesis. The effect on PHA production of the iterative rounds of model-guided genetic modifications was subsequently evaluated by means of high-throughput physiological experiments. Finally, we discuss the impact of synthetic and systems approaches towards the industrial production of PHA from other inexpensive substrates such as sugars and glycerol using P. putida as a bacterial chassis.ES Pseudomonas putida KT2440 es una bacteria modelo en biotecnología que suscita mucho interés como catalizador celular, y que es susceptible de ser optimizado mediante herramientas de biología sintética y de sistemas. Su metabolismo se ha caracterizado ampliamente y se cuenta con un modelo metabólico muy preciso (iJN1411), que permite la evaluación de sus capacidades metabólicas mediante una aproximación de biología de sistemas. Entre las aplicaciones biotecnológicas, KT2440 se ha usado ampliamente para la producción de PHA. Esta familia de poliésteres presenta propiedades interesantes para reemplazar a los plásticos de origen petroquímico. El metabolismo de PHA en P. putida está mediado por la PHA sintasa (PhaC) y la PHA despolimerasa (PhaZ), que sintetiza y degrada el PHA, respectivamente, en un ciclo continuo. Los PHA se producen a partir de fuentes renovables y se acumulan en el citoplasma bacteriano como fuente de reserva de carbono y energía. Sin embargo el metabolismo de PHA va más allá de ser una mera reserva de carbono, ya que estudios recientes han determinado su función como un ciclo “amortiguador”, capaz de mejorar la adaptación del microorganismo ante diferentes perturbaciones ambientales.En el primer capítulo de la sección de Resultados se describe en profundidad la evaluación del carácter amortiguador del ciclo de PHA, validándose su capacidad de conferir robustez metabólica a P. putida. Con el fin de evaluar el efecto del bloqueo del ciclo continuo de PHA en la fisiología de la bacteria, se ha construido una cepa mutante donde se ha delecionado el gen phaZ. Se ha validado una librería de cepas derivadas de la cepa mutante ΔphaZ con diferentes niveles de expresión del gen phaZ. Para investigar el impacto de la variación en la producción de PhaZ en el metabolismo de Pseudomonas, se han determinado en cada cepa diferentes parámetros fisiológicos en condiciones de producción de PHA. Estos resultados sugieren un cambio del flujo de carbono cuando se interrumpe el ciclo de PHA. En general, las cepas con diferente expresión de phaZ han mostrado cambios importantes, como por ejemplo, la tasa de crecimiento, la tasa de consumo de octanoato, el octanoato residual y la presencia de metabolitos extracelulares. Para relacionar estos resultados con el metabolismo general del carbono, estos datos experimentales se han contextualizado in silico en el modelo metabólico iJN1411, incluyendo la presencia del metabolismo oxidativo residual, durante la fase estacionaria del crecimiento asociada en el alto flujo mediante el ciclo de PHA. Por último, se discute en profundidad el impacto del ciclo de PHA en la fisiología de esta bacteria modelo.En el segundo capítulo de los Resultados, se estudia cómo la redundancia funcional puede ser un mecanismo de robustez en relación con los roles fisiológicos de las isoenzimas de la isocitrato deshidrogenasa procariota (PIDH). La PIDH es una enzima ancestral y muy diversa en cuanto a su origen y estructura primaria. Hay gran cantidad de trabajos disponibles sobre la caracterización de las propiedades bioquímicas de estas enzimas en una variedad de organismos. Sin embargo, no está claro cuál es la relevancia de la existencia de dos PIDH diferentes en las bacterias de género Pseudomonas, ya que esto es una característica observada principalmente en psicrófilos. En este capítulo, se presentan los resultados de la purificación y caracterización enzimática de las dos PIDH de P. putida. Los aminoácidos clave para la actividad catalítica en la Idh monomérica se verifican mediante mutagénesis dirigida. Para estudiar el impacto de la presencia de dos PIDH, se han evaluado los niveles de expresión de ambos genes mediante experimentos de qRT-PCR en diferentes condiciones de crecimiento. Finalmente, para estudiar el papel de las dos PIDH en la fisiología y metabolismo de P. putida, se diseñaron diferentes mutantes de deleción de la isocitrato deshidrogenasa. Los resultados indican que sólo se puede obtener el mutante de deleción de la Icd dimérica, lo que sugiere que la Idh monomérica podría ser un gen esencial en P. putida. El tercer capítulo de Resultados profundiza en la creación de factorías celulares para producir PHA a partir de sustratos complejos. En particular, los sustratos generados a partir de la descomposición de la lignina y de los plásticos basados en combustibles fósiles, como el tereftalato de polietileno (PET) y el poliuretano (PU). Presentamos un conjunto de cepas de P. putida super-productoras de PHA capaces de utilizar in silico hidrolizados PET y PU como fuentes de carbono. Se adoptan abordajes de vanguardia de biología sintética y de sistemas integrados en ciclos interactivos de optimización de Diseño, Construcción, Prueba, y Aprendizaje (DBTL). El modelo de P. putida, iJN1411, se utilizó como plataforma computacional para lograr la producción de PHA acoplada al crecimiento. Además, estos diseños in silico fueron implementados, evaluados y optimizados in vivo. Para ello se utilizan técnicas clásicas de biología molecular para delecionar un gran número de genes necesarios e introducir otros, para eliminar sistemáticamente todas las vías potencialmente competidoras con nuestro diseño in silico, y redirigir el flujo de carbono hacia la biosíntesis de PHA. El efecto de las rondas iterativas de modificaciones genéticas guiadas por el modelo iJN1411 sobre la producción de PHA, se evalúan mediante experimentos fisiológicos. Finalmente, se discute el posible impacto de las herramientas de biología sintética y de sistemas en la producción industrial de PHA a partir de sustratos sostenibles como azúcares y glicerol, utilizando P. putida como chasis bacterianoHorizon 2020 de la Unión Europea en virtud de los acuerdos de subvención número 633962 (proyecto P4SB) y 814418 (proyecto SinFonia). Proyectos BIO2017-83448-R_TECMABIO proyecto y BIO2014-59528-JIN _RobDcode del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Proyecto P2018NMT_4389 de la Comunidad de MadridPeer reviewedCSIC - Centro de Investigaciones Biológicas Margarita Salas (CIB)Universidad Complutense de MadridPrieto, María AuxiliadoraNogales, JuanMinisterio de Ciencia, Innovación y Universidades (España)Manoli, Maria-Tsampika 0000-0002-3075-4634Consejo Superior de Investigaciones Científicas [https://ror.org/02gfc7t72]202120212020info:eu-repo/semantics/doctoralThesishttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06http://hdl.handle.net/10261/226479reponame:DIGITAL.CSIC. Repositorio Institucional del CSICinstname:Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)EspañolSíinfo:eu-repo/semantics/openAccessoai:digital.csic.es:10261/2264792026-05-22T06:33:51Z
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