Inmovilización de transaminasas y amonio liasas y su aplicación en síntesis de compuestos aminados
El objetivo del presente trabajo de tesis es establecer métodos biocatalíticos para la síntesis de los aminoácidos L-fenilalanina, L-aspartato, β-aminobutirato y de las aminas aromáticas 1-feniletilamina y 3-amino-1-fenilbutano, usando biocatalizadores con actividad transaminasa y amonio liasa inmov...
| Autor: | |
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| Tipo de recurso: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2013 |
| País: | España |
| Institución: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | español |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:114030 |
| Acceso en línea: | https://ddd.uab.cat/record/114030 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Biotransformació (Metabolisme) Compostos amònics |
| Sumario: | El objetivo del presente trabajo de tesis es establecer métodos biocatalíticos para la síntesis de los aminoácidos L-fenilalanina, L-aspartato, β-aminobutirato y de las aminas aromáticas 1-feniletilamina y 3-amino-1-fenilbutano, usando biocatalizadores con actividad transaminasa y amonio liasa inmovilizados por técnicas de formación de enlaces covalentes (en el caso de enzimas) y por atrapamiento (tanto para enzimas como para células). Se establecieron dos métodos enzimáticos para la síntesis del aminoácido aromático esencial L-fenilalanina (Phe). El primer método de síntesis se realizó usando como biocatalizador L-aspartato transaminasa (13T) de corazón porcino inmovilizado. Se optimizaron los métodos de inmovilización de 13T en los soportes Eupergit® C, MANA-agarosa y LentiKats®. Los biocatalizadores inmovilizados resultantes se emplearon en la síntesis de Phe. La inmovilización en Eupergit® C y LentiKats® permitió mejorar la estabilidad del enzima 13T, así como alcanzar rendimientos de reacción de síntesis de Phe superiores al 70%. Además se estableció un método de síntesis multienzimática "one-pot", para lo que se acoplaron las reacciones catalizadas por los enzimas aspartasa (AspB) y transaminasa (AT). Se determinó la compatibilidad de los enzimas en las condiciones de reacción (pH 7,5 y 37°C) y se establecieron las concentraciones óptimas de los sustratos (0,15 M de fumarato, 0,3 M de NH4Cl y 0,1 M de fenilpiruvato) y de los enzimas (0,3 U de AspB/mL y 2 U de AT/mL). En estas condiciones, se alcanzó un rendimiento global de reacción de 80%. Para la síntesis de L-aspartato (Asp) se utilizó el enzima L-aspartato amonio liasa o aspartasa (AspB) de Bacillus sp. YM55-1 parcialmente purificado. El enzima se inmovilizó en los soportes Eupergit® C, MANA-agarosa y LentiKats®. Los biocatalizadores inmovilizados se emplearon en la síntesis de altas concentraciones de Asp (≥ 60 g/L). Además, el enzima inmovilizado se reutilizó eficientemente en la síntesis del aminoácido, manteniendo alrededor del 90% de su actividad inicial al cabo de 5 ciclos de reacción en todos los casos. La síntesis de las aminas aromáticas 1-feniletilamina (FEA) y 3-amino-1-fenilbutano (AFB) se llevó a cabo utilizando biocatalizadores (células y/o enzima parcialmente purificado) con actividad ω-transaminasa (ω-TA). Se estableció un método de permeabilización de las membranas de células ω-TA utilizando bromuro de cetrimonio (CTAB). Las células ω-TA se inmovilizaron en el soporte LentiKats® con un 100% de retención de su actividad catalítica. El enzima ω-TA se inmovilizó en varios soportes, obteniéndose los mejores resultados en Eupergit® CM y LentiKats®. La inmovilización en LentiKats®, tanto de células (no permeabilizadas y permeabilizadas) como del enzima, permitió la reutilización de los catalizadores hasta en 5 y 10 ciclos de síntesis de AFB, manteniendo alrededor del 80 y 70% de la actividad inicial, respectivamente. Por último, se comprobó que el enzima aspartasa mutado (AspB-C6) a partir de AspB, cataliza la reacción de aminación regioselectiva del ácido crotónico para producir β-aminobutirato. Este enzima se inmovilizó en los soportes Eupergit® C y MANA-agarosa según los métodos de inmovilización establecidos para el enzima AspB en los mismos soportes. Se obtuvieron rendimientos de inmovilización similares pero las actividades retenidas fueron significativamente inferiores para AspB-C6 que para AspB. |
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