Development of tools for monitoring and controlling cell cultures through the metabolic analysis
Les cèl·lules de mamífer esdevenen un dels principals sistemes per a la producció d'una àmplia gamma de proteïnes. Al voltant del 60-70% de tots els productes biofarmacèutics es produeixen en cèl·lules de mamífer gràcies a la capacitat d'aquestes cèl·lules de realitzar complexes modificaci...
| Autor: | |
|---|---|
| Formato: | tesis doctoral |
| Fecha de publicación: | 2018 |
| País: | España |
| Recursos: | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Repositorio: | Dipòsit Digital de Documents de la UAB |
| Idioma: | inglés |
| OAI Identifier: | oai:ddd.uab.cat:202121 |
| Acesso em linha: | https://ddd.uab.cat/record/202121 |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palavra-chave: | Cultius cel·lulars Metabolisme cel·lular |
| Resumo: | Les cèl·lules de mamífer esdevenen un dels principals sistemes per a la producció d'una àmplia gamma de proteïnes. Al voltant del 60-70% de tots els productes biofarmacèutics es produeixen en cèl·lules de mamífer gràcies a la capacitat d'aquestes cèl·lules de realitzar complexes modificacions post-translacionals per produir proteïnes biològicament actives. Una de les principals limitacions de les cèl·lules de mamífer és el seu ineficient metabolisme en cultiu, caracteritzat pel consum de grans quantitats de glucosa i la alta producció de subproductes no desitjats, com l'amoníac i el lactat, que afecten negativament el creixement cel·lular. En el treball presentat en aquesta tesi, s'observa que sota certes condicions de cultiu, les cèl·lules de mamífer son també capaces de consumir el lactat, mantenint-se en la fase de creixement exponencial. Els capítols 3 i 4 es centren en presentar les diferents fases del metabolisme de la glucosa i lactat en dues línies cel·lulars: HEK293 i CHO. Depenent de les condicions de cultiu, s'han obtingut tres metabolismes diferents: Fase 1: consum de glucosa i producció de lactat (creixement exponencial), Fase 2: consum simultani de glucosa i lactat (creixement exponencial) i Fase 3: consum de lactat com a única font de carboni (sense creixement cel·lular). L'obtenció d'aquestes diferents fases metabòliques depèn principalment de dues condicions de cultiu: el pH i la concentració extracel·lular de lactat. Per realitzar un estudi més profund de les diferents fases presentades, s'ha realitzat un anàlisi de la distribució de flux intracel·lular mitjançant un Flux Balance Analysis (FBA). Aquest anàlisi demostra que, a la Fase 1, la generació de lactat es deguda a que el piruvat es converteix en lactat per complir els requisits de regeneració de NADH en el citoplasma i només una petita quantitat de piruvat s'introdueix en el TCA a través del Acetyl-CoA. En el consum concomitant de glucosa i lactat (Fase 2), el consum de glucosa es redueix significativament i es s'aconsegueix un equilibri entre la glicòlisi i els fluxos del TCA, produint un consum de substrats molt més eficient. Un cop entès el metabolisme de les cèl·lules de mamífer en cultiu, el següent pas és aplicar aquest coneixement en l'àrea de l'enginyeria de bioprocessos. Amb aquesta finalitat, en el capítol 5 es presenta una nova eina de monitoratge en línia en Bioreactor basada en la mesura de l'addició de base per mantenir el pH constant. Aquesta nova eina és comparada amb una eina de monitoratge àmpliament utilitzada basada en la mesura de la velocitat de consum d'oxigen (O.U.R.), mitjançant l'aplicació del mètode dinàmic. Les dues alternatives presentades han demostrat avantatges clars pel que fa a la concentració de producte final i, especialment, a les productivitats volumètriques. No obstant això, s'han obtingut millors resultats amb l'estratègia basada en l'addició de base, augmentant la concentració total de cèl·lules viables i la concentració final de producte en un 178% i un 257%, respectivament, i obtenint un increment del 109% de la productivitat volumètrica del procés respecte al cultiu de referència en Batch. Aquesta diferència entre les dues estratègies aplicades es deu a les distorsions constants que pateix el cultiu en quant al pO2 i pH realitzades a cada mesura de la velocitat de consum d'oxigen amb el mètode dinàmic. Per tancar el treball realitzat, en el capítol 6 es presenta un mètode no invasiu per a la determinació de la O.U.R. com alternativa al mètode dinàmic. Els resultats demostren que el mètode desenvolupat és una alternativa fiable per monitoritzar l'activitat metabòlica, sent una eina útil per a la implementació d'estratègies de cultiu on la finalitat és l'obtenció d'altes densitats cel·lulars basades en el seguiment de la O.U.R.. |
|---|