Seleção de fragmentos de anticorpos recombinantes humanos contra galectina-3 por eletroforese capilar associada à técnica Phage Display
A galectina-3 (Gal-3) é uma proteína multifuncional presente em diversos processos fisiológicos e patológicos incluindo desenvolvimento tumoral, metástase e insuficiência cardíaca. Uma das ferramentas disponíveis para o estudo dessas proteínas é a técnica Phage Display, que proporciona a expressão d...
| Autor: | |
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| Tipo de recurso: | tesis de maestría |
| Estado: | Versión publicada |
| Fecha de publicación: | 2019 |
| País: | Brasil |
| Institución: | Universidade de São Paulo (USP) |
| Repositorio: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
| Idioma: | portugués |
| OAI Identifier: | oai:teses.usp.br:tde-23032022-145945 |
| Acceso en línea: | https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-23032022-145945/ |
| Access Level: | acceso abierto |
| Palabra clave: | Capillary electrophoresis Eletroforese capilar Galectin-3 Galectina-3 Phage display |
| Sumario: | A galectina-3 (Gal-3) é uma proteína multifuncional presente em diversos processos fisiológicos e patológicos incluindo desenvolvimento tumoral, metástase e insuficiência cardíaca. Uma das ferramentas disponíveis para o estudo dessas proteínas é a técnica Phage Display, que proporciona a expressão de uma biblioteca combinatória de fragmentos de anticorpo expressa na superfície de bacteriófagos e a seleção de unidades capazes de se ligar a um determinado alvo. Essa última etapa, ou seja, a seleção de unidades é denominada de panning e apresenta limitações como possibilidade de selecionar alvos inespecíficos, dificuldade de utilizar proteínas alvos de baixa massa molecular e rotina excessivamente trabalhosa e longa. Assim, neste trabalho foi utilizada a eletroforese capilar (EC), uma técnica de separação compatível com análise de proteínas e vírus, no desenvolvimento de um método para seleção de fragmentos de anticorpos específicos para a Gal-3 no contexto da tecnologia de Phage Display. Inicialmente, amostras de Gal-3 foram expressas em culturas de E. Coli e purificadas em coluna de afinidade sepharose-alfa-lactose. Em seguida as proteínas foram analisadas por EC e as seguintes condições foram escolhidas: eletrólito de corrida Tris-HCl 50mM pH 6,8, Tensão 20kV, 18ºC, aditivo trietilamina 4mM, concentração de Gal-3 50 µg/mL, 1psi de injeção por 10 segundos, capilar de 30cm com revestimento interno PVA. Em seguida, a amostras de Gal-3 foram incubadas com a biblioteca de fragmentos de anticorpos fusionados a bacteriófagos e separados em EC com as mesmas condições, utilizando os mesmos princípios do panning clássico, porém com a inclusão de uma técnica analítica de separação. Após a incubação com a biblioteca, foi observada com 8 minutos de análise a migração do complexo [Gal-3+Fago], que foi coletado e amplificado com sucesso. Apesar de mais estudos serem necessários para comprovar a possibilidade da técnica analítica de EC ser utilizada como uma ferramenta alternativa ao panning tradicional, esse trabalho revelou um potencial promissor dessa prática, que pelas características da EC poderá contribuir com seletividade e rapidez. |
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